2015藥典 非無菌產品微生物限度檢查：微生物限度檢查 微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準時，應按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

微生物計數(shù)試驗應在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于 B 級的單向流空氣區(qū)域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期進行監(jiān)測。

如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。

計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微 生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。

供試品檢查時, 應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù) 方法，所選的方法必須具備檢測充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗結果能 夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經確認。

菌種及菌液制備

試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌 種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學 特性。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表 1。

菌液制備 按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管 內，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應在 2 小時內使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小時內使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8℃，在驗證過的貯存期內使 用。

二、陰性對照

為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗， 陰性對照試驗應無 菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

培養(yǎng)基適用性檢查 微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基適用性檢查。

按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表 1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。

每一試驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿。同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培 養(yǎng)基進行上述試驗。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應在 0.5-2 范圍內，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基 管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應生長良好。

供試液制備 

根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液

制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過 45℃。供試液從制備至加入檢驗 用培養(yǎng)基,不得超過 1 小時。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應 建立其他適宜的方法。

⑴ 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。 若需要，調節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

⑵ 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩 沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。 分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供試品分散均勻。若需要，調節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將 供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⑶油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少 量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80 或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分 混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40℃（特殊情況下，最多不超過 45℃）， 小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋液使成 1∶10 供試液， 保溫，混合，并在最短時間內形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性 劑的稀釋液進一步 10 倍系列稀釋。

⑷需用特殊方法制備供試液的供試品

⒉ 接種和稀釋
按下列要求進行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應不超過供試液體積的 1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。

（1） 試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供試品對照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

（3）菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因導致無法選擇最低稀釋級的供試 液進行方法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果 供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋 或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適應性試驗。

⒊ 抗菌活性的去除或滅活

供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的 50%，可采用下 述方法消除供試品的抑菌活性。

⑴增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。

⑵加入適宜的中和劑或滅活劑。

⑶采用薄膜過濾法。

⑷上述幾種方法的聯(lián)合使用。 若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有抗菌活性，同時也表明供試品不可能被該類微生物污染。但 是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。 因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果 判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用 性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供 試液進行供試品檢查。

⒋ 供試品中微生物的回收

⑴ 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至 少制備 2 個平皿，以算術均值作為計數(shù)結果。

傾注法 取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅 活”制備的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中, 注入 15～20ml 溫度不超過 45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。 同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取 15～20ml 溫度不超過 45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基，注入直徑 90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng) 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應相應增加。每一平板表面 接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備的供 試液不少于 0.1ml。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液 對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

⑵ 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于 0.45μm,直徑一 般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。
選擇濾膜材質時 應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適 宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前 先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應充分 干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾 膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一 般為 100ml?？倹_洗量不得超過 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備 的供試液適量（一般取相當于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌 數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖 洗液沖洗濾膜。

若測定需氧菌總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上； 若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。

按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

⑶ MPN 法 MPN 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在 供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。若 使用 MPN 法，按下列步驟進行。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備 的供試液至少 3 個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9～ 10ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)基 中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管置 30～35℃培養(yǎng) 3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供 試品的原因使得結果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng) 1～2 天，觀察是否有微生物生長。 根據微生物生長的管數(shù)從表 3 查對被測供試品每 1g 或每 1ml 中需氧菌總數(shù)的最 可能數(shù)。

⒌ 結果判斷

計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法或時，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在 0.5～2 范圍內；采用 MPN 法，試驗組菌數(shù)應在菌液對照組菌數(shù)的 95%置信限內。若各試驗菌的回收試 驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總 數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不 到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。